背景：

由病原真菌引起的植物病害對全球糧食產(chǎn)業(yè)和水果工業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟影響。施用有機肥并輔以生防微生物（即生物有機肥）已被證明能夠提高植物對病原菌的抵抗能力，其中部分原因是生物有機肥影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。然而，目前尚不清楚這些效應(yīng)是由微生物菌劑的特殊作用、有機肥料中自然存在的微生物種群還是堆肥基質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)所驅(qū)動的。本研究旨在探究生物有機肥抑制病害的生態(tài)機制。

結(jié)果：

為了弄清生物有機肥的作用機理，我們調(diào)查了三個生長季節(jié)中香蕉枯萎病的發(fā)病情況及對應(yīng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并設(shè)置了以下4種處理：生物有機肥（含解芽孢桿菌W19）、有機肥、滅菌有機肥、輔以解淀粉芽孢桿菌W19的滅菌有機肥。我們發(fā)現(xiàn)，在整個種植季節(jié)，重新接種芽孢桿菌的滅菌生物有機肥與未滅菌的生物有機肥具有相似的抑病效果。我們進一步觀察到，這些處理中的病害抑制與土壤微生物群落有關(guān)，特別是增加特定假單胞菌的情況下。在實驗室盆栽試驗中進一步研究了芽孢桿菌改良劑和本地假單胞菌之間的相關(guān)性，這可能是抑制病原菌的基礎(chǔ)。這些研究表明，特定的細菌類群協(xié)同增加生物膜的形成，并可能作為一個植物有益的聯(lián)合體對抗病原菌。

結(jié)論：

我們論證了生物有機肥的作用，主要由其中的生防菌劑對其土壤微生物群落造成影響來發(fā)揮作用。這個研究為未來有效利用生物肥料促進土壤菌群功能的設(shè)計提供了理論依據(jù)，

關(guān)鍵詞：

生物有機肥、枯萎病、病害抑制、常駐微生物群、假單胞菌屬、種間協(xié)同作用

1  材料和方法

1.1  材料和試驗設(shè)置

試驗地：海南省樂東縣尖峰鎮(zhèn)萬中有限公司溫室

供試樣品：香蕉（連續(xù)種植3年）

供試土壤：連作香蕉10年以上且枯萎病發(fā)病率高的連作土

土壤處理：見下表

1.2  方法

a、土壤樣品和DNA提取：根際土+ 非根際土，使用PowerSoil DNA分離試劑盒提取DNA

b、細菌和真菌群落測序（16SrRNA、 ITS）

c、生物信息學(xué)分析（生成分類單元（OTU）、方差分析）

d、實時定量PCR分析（qPCR）

e、可培養(yǎng)鐮刀菌和芽孢桿菌的測定（10倍稀釋平板法）

f、假單胞菌CFU定量（10倍稀釋平板法）、菌株分離鑒定、鐮刀菌抑制（雙重培養(yǎng)法）、生物膜形成（改良結(jié)晶紫法）、芽孢桿菌吸引試驗（V型培養(yǎng)）

g、假單胞菌對植物病害水平的影響

h、假單胞菌共培養(yǎng)對尖孢鐮刀菌（FOC）密度的影響

2  結(jié)果與分析

2.1  香蕉枯萎病發(fā)病率：

在試驗的所有三個季節(jié)中，生物肥處理（OF+W19和SOF+W19）（Duncan檢驗，P<0.05）都降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率，與有機肥處理（SOF和OF）相比，OF+W19在每個季節(jié)的發(fā)病率最低（圖1A）。SOF+W19組和SOF+W19組的發(fā)病率無顯著性差異（Duncan檢驗，P>0.05），而OF+W19和SOF+W19處理間的發(fā)病率無顯著性差異（P>0.05）。

圖1：（A） 四種施肥處理對香蕉枯萎病發(fā)病率的影響。（B） 第二季根際土壤中尖孢鐮刀菌的可培養(yǎng)豐度、總豐度和相對豐度。

 

2.2  微生物群落組成

從微生物群落組成的分析，A圖中根際土壤和非根際土壤的細菌存在顯著差異，B圖中的真菌則沒有差異。總的來說，根際土壤細菌的相似性是大于非根際土壤細菌的相似性的，而真菌群落對不同施肥制度沒有表現(xiàn)出明顯的一個變化模式。結(jié)構(gòu)方程模型（通徑分析）（圖2C）表明，解釋病害的最強驅(qū)動力是病原菌密度（r=0.459，p=0.003），其受根際細菌群落組成的負影響（r=-0.360，p=0.015）。非根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了根際細菌群落的組成（r=0.756，p=0.005）。

圖2：細菌（A）和真菌（B）群落組成的非度量多維標度（NMDS）排序；（C）合并的結(jié)構(gòu)方程模型

 

2.3  微生物響應(yīng)類群

我們進一步研究了哪些細菌OTUs與特定施肥處理和香蕉枯萎病的程度相關(guān)。基于線性判別分析（LDA），233株根際細菌OTUs在不同施肥條件下存在差異。與有機肥處理相比，生物有機肥處理富集了43個OTU（豐度增加了2倍以上）。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)34個OTU與疾病發(fā)生率相關(guān)（FDR<0.05）（圖3A）。在這些反應(yīng)性微生物類群中，優(yōu)勢類群OTU7，被指定為假單胞菌屬，顯示出一個特別顯著的模式，促使對這個OTU進行更詳細的檢查。在生物肥料處理中，假單胞菌OTU7的相對豐度最高，分別占OF+W19和SOF+W19細菌群落總數(shù)的4.94%和3.27%（圖3B）。相比之下，在OF和SOF處理中，OTU僅占細菌總數(shù)的1.00%和1.25%（圖3B）。此外，假單胞菌OTU7與枯萎病發(fā)病率呈負相關(guān)（P<0.001）（圖3C）。

圖3：（A）1） OTUs的門級分類；2）OTUs對四個處理有顯著反應(yīng)（LDA>2）；3）OTUs的倍數(shù)變化；4）OTU相對豐度與發(fā)病率的相關(guān)性；5） OTU相對豐度的變化規(guī)律。（B）不同處理間假單胞菌OTU7的相對豐度。（C）線性回歸OTU7假單胞菌相對豐度與發(fā)病率的關(guān)系。群體間的線性回歸關(guān)系土壤（D）和根際土壤（E）中芽孢桿菌和假單胞菌的總密度。

2.4  假單胞菌及其對鐮刀菌的抑制、生物膜形成和芽孢桿菌吸引特性

從經(jīng)生物有機肥和有機肥改良的根際土壤微生物群中隨機分離鑒定出88株假單胞菌，根據(jù)16S rRNA基因序列，代表14個不同的系統(tǒng)發(fā)育群（圖4A）。共有36株菌株對枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，F(xiàn)OC）表現(xiàn)出拮抗作用，其中生物有機肥處理（OF+W19）的假單胞菌比例高于有機肥處理的菌株（t檢驗，P<0.01，圖4B）。52%的根際土壤中的假單胞菌對溶淀粉雙歧桿菌W19沒有影響，而根際土壤中有74%的假單胞菌對W19有抑制作用（t檢驗，P<0.01，圖4B）。

圖4：（A）樹枝圖顯示88株根際土壤假單胞菌與OTU7之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。葉標簽表示代表性序列ID。內(nèi)環(huán)表示物種級別的分類學(xué)，外圈表示從中分離菌株的處理的土壤。（B）在我們的雙重激發(fā)試驗中，具有FOC抑制能力，具有解淀粉芽孢桿菌W19抑制能力的假單胞菌的百分比，與W19共培養(yǎng)生物膜試驗中具有生物膜增強作用的假單胞菌的百分比

2.5  假單胞菌PSE78的抑病能力及其與溶淀粉雙歧桿菌W19的相互作用

假單胞菌PSE78對枯萎病有較強的抑制作用（圖5A）。與對照組和其他處理相比，PSE78處理組的發(fā)病率較低（Duncan檢驗，P<0.05），平均值為12%，而假單胞菌菌株P(guān)SE82與SOF處理比較，發(fā)病率無差異（Duncan檢驗，P>0.05）（圖5A）。芽孢桿菌和假單胞菌數(shù)量呈正相關(guān)（P<0.001，圖5B）。雖然這三種菌株單獨使用時都在一定程度上降低了FOC密度，但當(dāng)PSE 78和W19共同接種在試驗土壤中時，F(xiàn)OC密度的降低幅度最大（圖5C）。有趣的是，PSE82與W19的組合在抑制病原體方面的效果不如這些菌株單獨使用（圖5C）。

圖5：（A）與滅菌有機肥（SOF）和化肥（CK）處理相比，接種PSE78和PSE82的滅菌有機肥處理土壤中香蕉枯萎病的發(fā)病率；（B）香蕉根際土壤芽孢桿菌和假單胞菌種群密度的線性回歸分析，符號顏色與A圖一致；（C）框線圖中給出的處理名稱相對應(yīng)，顯示在指定預(yù)處理基質(zhì)上生長的植物根系上的FOC數(shù)量。

3  結(jié)論

作者在一個概念模型（圖6）中總結(jié)了實驗結(jié)果，該模型描述了施用生物有機肥抑制枯萎病的作用模式。

生物制劑B. amyloliquefaciens W19能夠在根際環(huán)境中建立（A）直接抑制病原菌的生長；（B）引起微生物組尤其是細菌部分的變化，對病原菌密度產(chǎn)生負面影響；（C）共同激活根際微生物群落中存在的特定有益植物相關(guān)微生物，（D）可能導(dǎo)致激活與特定植物有益細菌屬（如假單胞菌屬）形成多物種生物膜，從而（E）直接或間接，限制真菌病原菌感染植物根部的能力。

圖6：生物有機肥改良土壤中植物根際發(fā)生的事件順序的概念模型

4 展望

作者展望：

未來的生物防治策略可能包括聯(lián)合接種協(xié)同作用的細菌物種，以促進土壤的抗病性等特定功能；此外，潛在的生防菌株也可能更多的被篩選出來，不僅是因為它們能夠拮抗特定病原體，而且能夠刺激潛在的協(xié)同寄居群體。

譯者期望：

本研究證實了生物有機肥在有效抑制病害發(fā)生方面的潛在微生物生態(tài)學(xué)機制，為通過具體管理措施誘導(dǎo)土壤抑病能力提供了理論基礎(chǔ)，為將來更有效地應(yīng)用生防菌劑促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展開辟了新的機會，也為含有多功能生防菌群生物有機肥的研制，以及高效生防菌株篩選提供了借鑒意義。

標題：Bio-organic fertilizers stimulate indigenous soil Pseudomonas populations to enhance plant disease suppression 期刊：Microbiome IF： 11.6 發(fā)表時間：2020 年 5 月 通訊作者：沈其榮 教授 主要單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 譯者：張帥 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 博士一年級